Moho azul del tabaco

Moho azul del tabaco Agente transmisor: Peronospora hyoscyami f sp. tabacina Forma de propagación: A través del aire

Moho azul del tabaco. Enfermedad devastadora causada por el mildiu velloso Peronospora hyoscyami f sp. tabacina , que afecta al tabaco (Nicotiana tabacum) (Lucas, 1980; Trigiano y col., 1985; Main, 1998; Ristaino y col., 2007; Voglmayr, 2008). Constituye un problema para muchas regiones del mundo como Estados Unidos, el Sudeste de Europa, el Medio Oriente y África.

En Cuba, apareció por primera vez en 1957 y no se presentó más hasta 1979, momento en el que destruyó alrededor del 95% del cultivo, con pérdidas que ascendieron a la cifra de 343 700 000 pesos (Batista, 1989). Por otra parte, en la campaña 1996/97 ocurrieron fuertes brotes epidémicos en la zona central y occidental del país. Esta enfermedad, es considerada la más importante para los semilleros y plantaciones del cultivo del tabaco en Cuba (Muiño, 1999).

Organismo Causal

El moho azul del tabaco, es una enfermedad causada por el mildiu velloso Peronospora hyoscyami f sp. tabacina (Voglmayr, 2008). Este pertenece al orden Peronosporales y a la clase oomycetes (seudohongos), la cual se incluye actualmente en el reino Cromista (Kirk y col., 2008).

Es un biótrofo obligado, que requiere del tejido vivo del hospedante para completar su ciclo de vida (Wolf y col., 1934; Lucas, 1975) y es capaz de infectar otras especies de Nicotiana spp (Lucas, 1980; Johnson, 1989). Forma estructuras sexuales y asexuales, denominadas oosporas y esporangiosporas respectivamente.

Las primeras, son producidas en el tejido de tallos y hojas de plantas de tabaco infectadas y cuando son maduras, usualmente presentan un color rojo marrón, con un diámetro de 20 a 60 micrómetros y talla que varía bajo diferentes condiciones (Hill, 1966; Milholland, 1980).

Las esporangiosporas son transparentes con aspecto de limón de 15 x 25 micrómetros y presentan una estructura de rama dicotómica, con una terminación curvada y ápices agudos. Estas emergen en un gran número a través de los estomas, son frágiles y de vida corta. También son sensibles a la luz ultravioleta y cuando se expulsan, la luz directa del sol destruye a la mayoría de ellas (Bashi y Aylor, 1983; Rotem y col., 1985; Aylor, 1986).

Razas de patógenos

Con relación a las razas de este patógeno existe una gran controversia. En 1964 se propuso que los aislados patógenos APT1 de especies de Nicotiana spp, incluyendo a Nicotiana tabacum, se considerarán formas especiales de Peronospora hyoscyami, bajo el nombre de Peronospora hyoscyami f sp. tabacina (Cline, 2009).

También, en 1970, se diferenciaron dos formas especiales APT2 y APT3, capaces de infectar un amplio grupo de especies de Nicotiana spp. La primera, se denominó Peronospora hyoscyami f sp. hybrida que infecta a N. hybrida y la segunda Peronospora hyoscyami f sp. velutina. No obstante, éstas no se consideraron como razas. En la literatura se plantea, que la distinción de estas formas especiales es inusual en hospedantes tan relacionados (Cline, 2009).

Estudios de biología molecular confirmaron la existencia de diversidad en poblaciones de P. hyoscyami f sp. tabacina, característica que tiene también implicaciones epidemiológicas (Spurr y Menetrez,1990). Sin embargo, al determinarse el polimorfismo entre una colección de aislados de Peronospora hyoscyami f sp. tabacina, obtenidos de campos de tabaco de Kentucky y otras regiones de los Estados Unidos, se observó que eran genéticamente homogéneos con bajos niveles de polimorfismo.

Esto sugiere, que en esta región las poblaciones del patógeno no presentan variabilidad genética. Además, el uso de marcadores RFLP indicó que la recombinación genética no ocurre con frecuencia en las poblaciones de P. hyoscyami f sp. tabacina (Sukno y col., 2002).

En Cuba

Finalmente, en Cuba no hay información disponible acerca de la presencia de razas del patógeno y son escasos los trabajos realizados sobre la variabilidad en las poblaciones del mismo.

Epidemiología

P. hyoscyami f sp. tabacina es un productor prolifero de esporas. Se estima que un promedio de 500 hectáreas de plantas enfermas, pueden formar alrededor de 6,44 x 1013 esporas por día (Aylor, 1986). Las epifitias producidas por este patógeno son usualmente cíclicas y progresivas y una vez establecidas, avanzan a través de las esporas en el aire.

En condiciones de baja intensidad solar, durante un período de tiempo de seis horas o más, el 80% de las esporangiosporas sobreviven en el aire. Sin embargo, en presencia de la máxima intensidad solar y en un tiempo aproximado de una hora, el 99% muere (Bashi y Aylor, 1983).

Otra forma de dispersión, ocurre a través del transplante de posturas infectadas (Main y col., 1996-1998) y también pueden ser diseminadas físicamente por el hombre (Aylor, 1986).

Una vez que las esporangiosporas llegan en las horas de la mañana a la superficie de la hoja, con el agua fría, la germinación y la infección puede ocurrir en menos de dos a cuatro horas (Wolf y col., 1934).

También, el patógeno puede completar su ciclo de vida en menos de diez días y producir una enfermedad policíclica (Main, 1998).

Las condiciones para la esporulación en las hojas de plantas infectadas, incluye una humedad relativa mayor del 95%, un intervalo de temperatura entre 18 y 23°C y un período de oscuridad de aproximadamente 12 horas (Wolf y col., 1934).

Entre los cinco y siete días tiene lugar un período de incubación sin la presencia de sintomatología. Finalmente, los primeros síntomas visibles aparecen entre los siete y 10 días aproximadamente.

Con relación a las fuentes de inóculo, se demostró que en las regiones del sur de los Estados Unidos, P. hyoscyami f sp. tabacina permanece sistémico en N. repanda, es capaz de esporular en condiciones favorables y es dispersado hacia las regiones del norte coincidiendo con la época del cultivo, lo cual constituye una fuente de inóculo permanente (David y col.,1990; David y Main, 1990). También, este oomycete puede mantenerse como micelio sistémico en restos de cosechas (Lucas, 1975).

Sintomatología

La enfermedad del moho azul puede causar síntomas variables, tanto en los semilleros y plantaciones de tabaco.

En semilleros, ocurre el amarillamiento y la reducción en forma acopada de las hojas, las cuales eventualmente adquieren una coloración marrón y mueren (Kucharek, 2001).

También, antes de la elongación del tallo, es posible el desarrollo de una infección sistémica severa, las hojas se distorsionan, se tornan de color amarillo y puede ocurrir una decoloración vascular (Kucharek, 2001).

En los campos donde se establece la infección, las plantas adultas presentan manchas de varias formas y tamaño, las cuales usualmente comienzan de color amarillo y luego adquieren un color marrón (Kucharek, 2001).

Las nuevas esporulaciones se localizan en la superficie abaxial de la hoja y presentan una coloración desde blanco a azul grisáceo que con la edad adquieren un color marrón (Kucharek, 2001).

Síntomas característicos de la enfermedad del moho azul del Tabaco producido por Peronospora hyoscyami f sp. tabacina> a: amarillamiento y reducción acopada de hojas en plantas jóvenes. b: presencia de manchas amarillas en hojas de plantas adultas. c, d: presencia de manchas de color marrón en hojas de plantas adultas, e: esporulación en hojas.

Proceso de infección

El proceso de infección de P. hyoscyami f. sp. tabacina comienza con la germinación de las esporas en la superficie de la hoja. Seguidamente, ocurre el desarrollo de un apresorio, que depende de una señal topográfica y específica proveniente de la superficie de la hoja de la planta (Lucas, 1975). Posteriormente, se forma la espiga de penetración, que entra a través del estoma, seguido del desarrollo de diferentes estructuras como la vesícula subestomática, hifa de infección, célula madre haustorial y el establecimiento de un haustorio, que constituye el paso final de la vía de infección (Lucas, 1975).

Los oomycetes establecen una relación íntima con sus hospedantes, producto de la formación del haustorio durante la infección. Esta permite la obtención de nutrientes, el redireccionamiento del metabolismo del hospedante, así como la supresión de sus defensas mediante la liberación de proteínas efectoras dentro del citoplasma (Hahn y Mendgen, 2001; Voegele y Mendgen, 2003; O’Connell y Panstruga, 2006; Whisson y col., 2007). Sin embargo, se conoce poco sobre los eventos moleculares y bioquímicos que tienen lugar en este proceso, durante la interacción P. hyoscyami f sp. tabacina – tabaco (N. tabacum).

Manejo integrado del moho azul

Medidas agrotécnicas

• El manejo integrado de plagas (MIP) trata de solucionar los problemas de plagas o enfermedades, utilizando las tácticas y herramientas disponibles, para impedir que las poblaciones de organismos dañinos alcancen densidades económicamente perjudiciales (González y col., 2007).

• Para un mejor manejo de la enfermedad moho azul y de esta forma disminuir las pérdidas, se recomienda utilizar áreas de cultivo con buen drenaje superficial e interno, no plantar posturas infectadas, así como arrancar y destruir las plantas afectadas.

• Las áreas de semilleros deben estar debidamente cercadas, aisladas de cultivos afines y con las cajuelas de desinfección de pies y de manos, habilitadas con algún desinfectante (González y col., 2007).

• También es de vital importancia cumplir con las orientaciones que se derivan del pronóstico establecido para el agente causal de la enfermedad (González y col., 2007).

Empleo de fungicidas

El empleo de fungicidas se requiere como tratamiento preventivo, en los primeros estadios de desarrollo del cultivo. En el caso de las variedades susceptibles, se necesitan entre ocho y 10 aplicaciones (Programa de defensa para el cultivo del tabaco, 2001).

Las estrategias de manejo con fungicidas incluyen diferentes medidas, donde los tratamientos preventivos con químicos a base de cobre, ocupan un lugar primordial (Ivers y col., 2006).

La enfermedad se puede controlar exitosamente con fungicidas sistémicos como el metalaxyl. Sin embargo, con el tiempo, éstos provocan el surgimiento de poblaciones resistentes del patógeno (Lyr, 1995), lo que ha traído como consecuencia el empleo de fungicidas sistémicos y de contacto.

En este caso, el MANCOZEB es el fungicida de contacto más utilizado, en mezclas o en tratamientos de alternancia (Muiño, 1999). En la actualidad, se utilizan diferentes combinaciones de fungicidas, que permiten una protección más eficiente (González y col., 2007).

Mejoramiento genético

El uso de variedades resistentes es una de las tácticas empleadas para el manejo integrado del moho azul. A partir de 1970, debido a que todas las variedades comerciales de tabaco eran susceptibles a esta enfermedad, se desarrollaron en Cuba nuevos programas de mejoramiento genético, utilizando como única fuente de resistencia a N. debneyi, para la obtención de variedades resistentes (Espino y col., 1998).

De estos programas, surgieron las variedades comerciales Habana 92 y Habana 2000 (Espino, 1996), las cuales en el año 1993 comenzaron a sembrarse a gran escala en algunas de las provincias centrales. Posteriormente, se extendieron a las provincias occidentales, lo que permitió una reducción de los niveles de inóculo en los primeros dos a tres años (Espino, 1996).

También se desarrollaron otras variedades como Criollo 98, Corojo 99 y Habana Vuelta Arriba, las cuales son empleadas en los programas de mejoramiento por su resistencia a la enfermedad (Espino y col., 1998). Sin embargo, en las últimas campañas las variedades comerciales actuales se han comportado de manera susceptible.

En Nicotiana tabacum, la resistencia al moho azul es baja (Rufty, 1989) y la mayoría de los cultivares comerciales son altamente susceptibles (Lea, 1963; Clayton y col., 1967). Por este motivo, es importante la búsqueda de nuevas fuentes de resistencia para ser introducidas en los programas de mejoramiento. Un ejemplo de ello lo constituyen las especies silvestres N. exigua (Hill, 1966), N. goodspeedii (Clayton, 1968), N. megalosiphon (Pérez y col., 2003), N. obtusifolia (Heist y col., 2004) y N. langsdorffii (Zhang y Zaitlin, 2008), las cuales son prácticamente inmunes a la enfermedad.

En el caso específico de N. megalosiphon y N. exigua, estas son fuentes de resistencia a las razas APT1, APT2, APT3 y PT-2 descritas para P. hyoscyami f sp. tabacina (Hill, 1966; Jankowski, 1971).

Marcadores moleculares de resistencia al moho azul del tabaco

La identificación de marcadores moleculares ligados a genes, que contribuyen a la resistencia a enfermedades, es una herramienta valiosa que incrementa la capacidad de eliminar líneas e individuos susceptibles, en las primeras etapas de los programas de mejoramiento de los cultivos (Milla y col., 2005).

Aunque el polimorfismo del ADN, revelado por marcadores moleculares, es generalmente bajo para N. tabacum (Nishi y col., 2003), la identificación de marcadores relacionados con genes de resistencia, transferidos al tabaco desde especies silvestres de Nicotiana spp se considera exitoso (Bai y col., 1995; Yi y Rufty, 1998; Yi y col., 1998; Johnson y col., 2002; Lewis, 2005).

Un grupo de marcadores RAPD relacionados con un gen que contribuye a la resistencia al moho azul, encontrado en el cultivar de tabaco Ovens 62, fue identificado a través del empleo del análisis de segregantes agrupados (Michelmore y col., 1991), el test F y el mapeo a intervalos (Lander y Botstein, 1989), las cuales son técnicas útiles para la identificación de marcadores moleculares, relacionados con genes o regiones específicas del genoma.

Dos de estos marcadores fueron convertidos a marcadores SCAR (Milla y col., 2005), lo que incrementa la especificidad y la reproducibilidad (Paran y Michelmmore, 1993). De la misma forma, Julio y col. (2006) desarrollaron dos marcadores SCAR, asociados con la resistencia a este patógeno, derivada de Nicotiana debneyi.

Interacción planta – patógeno

Sistema de inmunidad innata

Durante la evolución, las plantas desarrollan estrategias que les permiten reconocer a los patógenos que las invaden y desencadenar una defensa efectiva. De la misma forma, los patógenos poseen mecanismos que les posibilitan evadir y/o suprimir las respuestas defensivas de la planta. Esto constituye una presión selectiva, que conlleva al perfeccionamiento de los mecanismos de defensa de las plantas. Debido a ello, el éxito del patógeno para causar una enfermedad, lejos de constituir la regla es una excepción (Staskawicz, 2001).

Las plantas son resistentes a la mayoría de los microorganismos patógenos mediante un mecanismo de defensa basal, denominado sistema de inmunidad innata (Jones y Takemoto, 2004; Chisholm y col., 2006; Jones y Dangle, 2006). Esta respuesta inmune se activa después del reconocimiento de los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), los cuales en ocasiones son referidos como elicitores generales (Zipfel y Felix, 2005; Jones y Dangle, 2006) e incluyen proteínas, péptidos, carbohidratos y lípidos (Zipfel y Felix, 2005).

En esencia, existen dos líneas de acción del sistema inmune de las plantas. La primera, utiliza los receptores de reconocimiento de patrones (PRRs), que responden lentamente a los PAMP, como es el caso de la flagelina (Zipfel y Felix, 2005). La segunda, actúa mayormente dentro de la célula y emplea las proteínas polimórficas con sitio de unión a nucleótidos y repeticiones de leucina (NBS-LRR), codificadas por la mayoría de los genes de resistencia (R) (Dangl y Jones, 2001). Diversos autores explican el sistema inmune de las plantas a través de un modelo de cuatro fases denominado modelo “zig-zag”.

En la fase uno, los PAMPs son detectados por los PRRs del hospedante, con la activación de una inmunidad inducida por los PAMPs (PTI), lo que puede detener la nueva colonización de la planta por el patógeno. En la segunda fase, los patógenos eficientes activan efectores que contribuyen a su virulencia, los cuales pueden interferir con la PTI y activar una susceptibilidad inducida por efectores (ETS).

En el caso de la fase 3 un efector determinado, es específicamente reconocido por una de las proteínas NBS-LRR, lo que trae como resultado una inmunidad activada por efectores (ETI). Esta es una respuesta PTI mayor y más rápida, que trae como resultado la resistencia a la enfermedad y usualmente produce una HR en el sito de infección.

En la fase cuatro, producto de la selección natural, los patógenos evitan la respuesta ETI ya sea evadiendo el gen efector de reconocimiento o por la adquisición de efectores adicionales que suprimen la ETI. Como resultado de la selección natural, en las plantas se generan nuevos genes R específicos, de tal forma que la ETI puede activarse otra vez (Jones y Dangl, 2006).

Reconocimiento del patógeno

El reconocimiento de los patógenos por las plantas, ocurre a través de elicitores generales y elicitores específicos de razas. Esto permite, la activación de la resistencia inducible en las plantas, la cual se clasifica en dos categorías: resistencia planta - patógeno general o inespecífica y resistencia específica.

La resistencia general alerta al sistema defensivo de la planta ante el contacto con elicitores generales, que caracterizan a grandes grupos de patógenos, como bacterias, hongos y virus. La resistencia específica se activa ante el reconocimiento de moléculas efectoras producidas por cada uno de los integrantes de estos grupos en particular y los distinguen hasta el nivel de cepa (Dangl y Jones, 2001).

Resistencia planta - patógeno general o inespecífica=

Este tipo de resistencia depende de muchos genes que codifican, para la presencia o formación de varias estructuras de defensa, preexistentes o inducidas y la producción de sustancias tóxicas que afectan al patógeno. Actúa en diferentes niveles contra varios patógenos, en absolutamente todas las plantas (Agrios, 2005).

Por otra parte, constituye una primera barrera de defensa frente al ataque de patógenos y se activa ante el reconocimiento de moléculas de superficie de variada naturaleza química, que caracterizan a los grandes grupos de patógenos. En las bacterias, estos elicitores generales están representados por la capa de lipopolisacáridos (LPS) de las Gram (-), que incluye el lípido A y el antígeno O, peptidoglicanos de las Gram (+) y proteínas como la flagelina de las Eubacterias.

Los oomycetes y los hongos poseen moléculas características como glicoproteínas, oligosacáridos, péptidos, carbohidratos y lípidos derivados de la pared celular (Shibuya y Minami, 2001). Estas moléculas son altamente conservadas y están relacionadas con funciones vitales, por lo que tienen una baja tasa de mutación. La estrategia de utilizarlas como elementos de identificación de un amplio grupo de organismos patógenos, es aplicada no solo por las plantas, sino también por los vertebrados e insectos, durante la activación de la respuesta inmune innata (Nurnberger y Bruner, 2002).

Resistencia planta - patógeno específica

En muchas interacciones planta – patógeno, especialmente aquellas en las que participan oomycetes biótrofos, hongos, nemátodos, virus y bacterias, la resistencia de la planta hospedante, ocurre a través de pares complementarios de genes (Agrios, 2005).

Las plantas poseen la capacidad de distinguir entre las distintas cepas de patógenos que la infectan y la activación de los mecanismos de respuesta de estas, se produce precisamente por la interacción de estos pares complementarios. Los mismos están formados por las proteínas de resistencia (R), resultantes de la expresión de genes dominantes o semidominante en las plantas, llamados genes R y los correspondientes factores de avirulencia (Avr), que resultan de la expresión de los genes dominantes Avr, presentes en cada cepa.

Por otra parte, el reconocimiento de los factores de avirulencia por las plantas hospedantes, desencadena la traducción de una o varias cascadas de señales que activan el sistema defensivo de la planta, comprometiendo así la habilidad del patógeno para colonizar la planta (Jones y Dangl, 2006).

En algunos casos, las proteínas Avr producidas por los patógenos, juegan un papel dual. Estas pueden actuar como efectores que se secretan y transfieren dentro del citoplasma del hospedante, para manipular la fisiología del mismo a su favor y causan la susceptibilidad (Jones y Dangl, 2006). Sin embargo, corren el riesgo de ser reconocidos por el sistema de supervivencia de la planta a través de los genes R. De esta forma, aquellos efectores que son utilizados por el patógeno como factores de virulencia, probablemente son transformados en factores de reconocimiento específicos que funcionan como determinantes de avirulencia para el hospedante (Luderer y Joosten, 2001), mediando la inmunidad de la planta activada por efectores (Jones y Dangl, 2006).

A diferencia de las proteínas Avr que son de estructuras muy diversas, las proteínas R presentan determinadas similitudes, de acuerdo a los dominios que las caracterizan. De manera general, estas proteínas tienen dominios ricos en repeticiones de leucina (LRR), dominios de unión a nucleótidos (NBD), dominios transmembrana (TM) y dominios proteína quinasa serina-treonina (PK). De acuerdo a su estructura, estas proteínas se clasifican en varias clases y entre ellas se encuentra las NBS-LRRs, LRR-TM-PKs, LRR-TMs y PKs.

La mayoría de las proteínas R presentan una estructura de tipo NBS-LRR y pueden dividirse, de acuerdo a la presencia de un dominio similar a los receptores de interleukina-1 (TIR) de mamíferos hacia el extremo N- terminal, de un ziper de leucina (LZ) o de un motivo en forma de cola superenrollada (CC) (Dangl y Jones, 2001). Se ha comprobado, que estos dominios permiten la realización de funciones relacionadas directamente con la percepción de moléculas.

Los dominios LRR, participan en la interacción proteína -proteína y se les atribuye una mayor contribución a la capacidad de los genes R al reconocimiento específico de moléculas. Luck y col. (2000), evidenciaron que los dominios TIR también participan en esta función y demostraron que cambios puntuales en estos dominios, localizados en genes de la serie alélica L, influyen en el reconocimiento de diferentes patógenos por plantas de lino (Linum usitatissimum). En el caso de los dominios NBS, está descrito que los mismos participan en la unión y la hidrólisis de ATP (Tameling y col., 2002).

En la literatura se describe, que la resistencia a enfermedades mediada por las proteínas NB-LRR, es efectiva para biótrofos o patógenos hemibiotróficos, pero no para patógenos que destruyen el tejido del hospedante durante la colonización (Glazebrook, 2005).

Existen dos hipótesis acerca de la percepción de las proteínas Avr del patógeno por la planta: la primera plantea la interacción directa “gen a gen” y la segunda aboga por la interacción indirecta a través de proteínas guardianas. En el primer caso se plantea, que existe una interacción física y directa entre la proteína R de la planta y la proteína Avr del patógeno.

Esta hipótesis se demostró para el par compuesto por la proteína Avr Pi-ta del hongo Magnaporhe grisea y la proteína Pi-ta del arroz (Oryza sativa) (Luderer, 2001). También esta teoría se comprobó durante la interacción entre la proteína Avr Pto de Pseudomona syringae y la proteína Pto del tomate (Lycopersicum esculentum). Se verificó que Pto no es una proteína R, sino una proteína diana de la virulencia de la planta y que otra proteína denominada Prf, es la que actúa como proteína de resistencia (van der Biezen, 2001).

Las proteínas dianas de la virulencia, se encuentran tanto en las plantas susceptibles como en las resistentes. Estos pueden interactuar con las proteínas Avr correspondientes, las cuales juegan un determinado papel en la virulencia del patógeno y que además constituyen una alerta, para la activación de los mecanismos de defensa de las plantas, en aquellas variedades resistentes que presentan la proteína R. En Arabidopsis thaliana se identificó la proteína RIN4, que actúa como proteína diana de virulencia e interactúa con las moléculas efectoras del tipo III (AvrRPM1 y AvrB) de Pseudomonas syringae, en la resistencia mediada por la proteína guardiana RPM1 (Mackey y col., 2002).

En el caso de la hipótesis de la proteína guardiana, se plantea que el producto Avr del patógeno interactúa con la proteína diana de virulencia de la planta, la cual sufre determinado cambio conformacional (fosforilación, miristoilación o ubiquitinación). Este cambio es detectado por la proteína R guardiana, que está asociada a la proteína diana como parte de un complejo de percepción / transducción y se desata así una cascada de señales, la cual activa el sistema defensivo de la planta (Dangl y Jones, 2001; Veronese y col., 2003).

Finalmente, la hipótesis de la proteína guardiana es la más aceptada. Esta refleja un mecanismo que puede contribuir a explicar, la amplia resistencia de las plantas a los genes Avr, que caracteriza a la gran cantidad de patógenos en la naturaleza en contraposición con el número de genes R que existe, el cual es insuficiente para que se cumpla la teoría de la interacción directa “gen a gen” (Nimchuk y col., 2001).

Mecanismos de Respuesta de la planta ante el ataque de patógenos

Las plantas responden al ataque de patógenos a través de la activación de una variedad de mecanismos protectores, que evitan la replicación del patógeno así como su dispersión (Malolepsza y Rózalska, 2005). Los mecanismos de defensa, incluyen la producción rápida de especies reactivas del oxígeno (ROS) (De Gran y col., 2003), alteraciones en la constitución de la pared celular, la acumulación de metabolitos secundarios conocidos como fitoalexinas (Heath,2000; Agrios, 2005), la activación y la síntesis de péptidos y proteínas de defensa (Castro y Fonts, 2005), la respuesta de hipersensibilidad (HR) y la producción de compuestos antimicrobianos (Conrath y col., 2002).

Los cambios de las propiedades de la pared celular, fundamentalmente en las células que se encuentran alrededor del sitio de penetración del patógeno, forman parte de las primeras respuestas que se detectan en la célula vegetal ante el ataque de patógenos.

Este fenómeno se caracteriza por cambios en la composición química de las paredes celulares, con la deposición de sustancias como sílice, calcio, lignina y suberina. También, se incrementa la producción de fenoles oxidados y de sustancias tóxicas como los sulfuros.

El reforzamiento de las paredes se produce debido al aumento del número de moléculas como las proteínas ricas en hidroxiprolinas (HRPG) y al establecimiento de enlaces cruzados entre las cadenas polipeptídicas (Agrios, 2005). Estos eventos, constituyen una barrera mecánica, que impide la dispersión y multiplicación del patógeno. Además, se incrementa la resistencia a la degradación enzimática de las proteínas de la pared, se reduce la difusión de sustancias del patógeno a la planta y viceversa y se afecta directamente la integridad del microorganismo mediante la acción de sustancias tóxicas.

La generación de ROS es una de las primeras respuestas celulares, durante el estrés oxidativo (Zhou y col., 2004). Se caracteriza por la acumulación de peróxido (H₂O₂), anión superóxido (O₂.-) y radicales hidroxilo (Nurnberger y Scheel, 2001). El H₂O₂, tiene actividad antimicrobiana e inhibe la germinación de las esporas de patógenos fungosos. También, participa en la formación de radicales fenoxilos durante la polimerización del fenol dentro de la pared celular de la planta (Lamb y Dixon, 1997).

Por otra parte, las ROS inducen la peroxidación lipídica, lo que permite la pérdida de la integridad de las membranas, la necrosis de los tejidos y la inducción de las fitoalexinas por la acción de las lipoxigenasas (LOX). Los metabolitos productos de estas enzimas, probablemente ejercen una actividad antimicrobiana directa e inducen o alteran la expresión de genes de defensa a heridas y patógenos (El- Khallal, 2007).

Las ROS deben ser eficientemente metabolizadas, ya que ellas rápidamente oxidan y dañan los lípidos de las membranas celulares, las proteínas y otros componentes de las células de la planta, lo que trae como consecuencia el mal funcionamiento celular y en última instancia su muerte o la aparición de lesiones necróticas (Doke 1997; Foyer y Noctor 2005). De esta manera, la acumulación excesiva de las ROS implica la activación de defensas adicionales (Doke 1997; Scandalios y col., 1997). Tal es el caso de la superóxido dismutasa (SOD) dependientes de Cu, Zn y Mn, las cuales forman la primera línea de defensa antioxidante que protege a la mitocondria del efecto negativo del O2.- (Millar y col., 2001; Moller, 2001).

Las peroxidasas (PO), son proteínas que también participan en la respuesta antioxidante en las plantas, las cuales catalizan la oxidación - reducción entre el H2O2 y varios agentes reductores (Hiraga y col., 2001). Estas enzimas pudieran participar en la producción y la eliminación de las ROS (Liu y col., 2005).

En las plantas, las PO pertenecen a la clase III (Duroux y Welinder, 2003) y son miembros de una gran familia. Asociado a estas respuestas antioxidantes se encuentra el glutatión en forma reducida (GSH), que participa en la reducción de las ROS a través del ciclo ascorbato – glutatión. Este puede funcionar como un modulador de las reacciones enzimáticas controladas por agentes REDOX (Paget y Buttner, 2003; Foyer y Noctor, 2005). También puede constituir un co-sustrato en procesos de conjugación y destoxificación, catalizados por las enzimas GSH transferasa, GSH peroxidasa y glioxalasas (Edwards y col., 2000).

En las respuestas defensivas de las plantas contra los patógenos, participan además diferentes proteínas y péptidos antimicrobianos. Entre ellos se encuentran las defensinas, tioninas, las proteínas de transferencia de lípidos (LTP), las fitoalexinas y los compuestos fenólicos, (Hernández y col., 2005).

Las defensinas y tioninas son péptidos de bajo peso molecular, ricos en cisteina, que se pueden encontrar en diferentes organismos como es el caso de plantas mono y dicotiledoneas (Bull y col., 1992; Broekaert y col., 1995). Estos péptidos pueden ejercer la actividad antifúngica a través de la alteración de la permeabilidad de las membranas o por inhibición de la biosíntesis de macromoléculas (Almeida y col., 2000; Liu y col., 2000).

Las LTP estimulan la transferencia de un amplio grupo de lípidos, a través de las membranas in vitro y pueden estar relacionadas con la secreción y la deposición de material lipofílico extracelular como cera y cutina. Son pequeñas proteínas con cuatro puentes disulfuro unidos a una cavidad hidrofóbica central, que tienen actividad in vitro contra bacterias y hongos, aunque el mecanismo de acción es desconocido. Estas proteínas, según criterio de algunos autores, pudieran insertarse en la membrana celular de los hongos, de manera tal que la cavidad central hidrofóbica forme un poro que permite un exflujo de iones y la muerte celular de los mismos (Selitrennikoff, 2001).

Las fitoalexinas son moléculas de bajo peso molecular, que presentan estructuras muy diversas. Se producen y acumulan solamente en los tejidos dañados de las plantas e impiden la expansión del microorganismo por toda la planta (Agrios, 2005).

Uno de los precursores de los compuestos fenólicos es la fenilalanina, la cual después de una infección o herida, se convierte a ácido trans-cinámico y entra a la vía de biosíntesis de los fenilpropanoides. Estos incluyen a varios grupos de fitoalexinas y precursores de sustancias relacionadas con la defensa, como por ejemplo la lignina (Lucas, 1998).

La ruta de los fenilpropanoides se activa de manera no específica, ante una serie de estímulos como es el caso de la infección por virus, hongos y bacterias. En respuesta a estos, se induce la expresión de genes que codifican para la fenilalanina amonio liasa (PAL) y la chalcone sintasa (CHS), las cuales son enzimas esenciales de este proceso. Algunos autores las clasifican dentro de las proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR) (Lucas, 1998).

Las proteínas PR son de bajo peso molecular, se producen durante la infección por varios tipos de patógenos y se acumulan en mayor proporción en los espacios intercelulares de los tejidos vegetales (Lucas, 1998). Estas pueden clasificarse en al menos 14 familias, representadas por ß-glucanasas, quitinasas, taumatinas, proteínas con actividad osmótica, proteinasas, peroxidasas, ribonucleasas y otras proteínas de función desconocida (van Loon y col., 2006).

La mayor parte de estos mecanismos defensivos están acoplados o culminan en el desencadenamiento de la respuesta hipersensible (HR). Este proceso es localizado, rápido y opera independientemente de la causa que provoca la agresión (estrés biótico o abiótico) (Beers y Mc Dowell, 2001). Se induce en el sitio dañado de la planta o en el lugar donde ocurre la penetración, destruye las células infectadas evitando la diseminación del patógeno e interfiere con la adquisición de nutrientes por parte de éste (Heat, 2000).

Esta respuesta, se caracteriza macroscópicamente por la necrosis de las células afectadas, en función del cambio en las membranas celulares y en su metabolismo. Algunos investigadores comparan este tipo de respuesta en plantas, con la apoptosis o muerte celular programada (PCD) en animales, debido a que en ambos procesos ocurren cambios morfológicos como la labilización de las membranas celulares, la condensación de la cromatina, la digestión del DNA, cambios en la transcripción y fosforilación de proteínas, aumento del metabolismo oxidativo y flujos de iónes a través de la membrana plasmática (Bolwell, 2004).

Existe otro tipo de mecanismo de respuesta que operan en las plantas, cuyo efecto perdura por un espacio de tiempo más prolongado después de la infección. Este es la Respuesta Sistémica Adquirida (SAR), la cual permite el mantenimiento del estado de “alerta” de la maquinaria defensiva de la planta y de la capacidad de responder más rápido y eficientemente a una infección posterior del patógeno (Conrath y col., 2002).

En plantas la SAR es una respuesta de resistencia secundaria, que se induce después de una respuesta hipersensible (HR) a un patógeno avirulento (Sticher, 1997). La señal para este tipo de respuesta se genera dentro de cuatro y seis horas después de la inoculación (Ryals y col., 1995).

Además, la SAR actúa de manera no específica a través de la planta y reduce la severidad de las enfermedades causada por todas las clases de patógenos. Se caracteriza por la inducción coordinada de genes en las hojas no infectadas de las plantas inoculadas, como es el caso de ß-1,3-glucanasas, quitinasas y otras proteínas PR. Aunque la SAR no afecta la germinación de la espora y la formación del apresorio, la penetración es reducida drásticamente quizás por el reforzamiento con lignina en la zona debajo del apresorio (Agrios, 2005).

Mecanismos de respuestas defensiva a P. hyoscyami f sp. tabacina

La interacción Nicotiana tabacum-P. hyoscyami f sp. tabacina, ocurre de manera similar a muchas interacciones establecidas por los oomycetes. Las esporangiosporas del patógeno germinan en la superficie de la hoja y seguidamente se forma un apresorio (Lucas, 1975). Recientes hallazgos mostraron, que un grupo de proteínas denominadas T- Phylloplanins, secretadas por los tricomas de la superficie aérea de las hojas de N. tabacum, inhibe la germinación y por tanto impide el desarrollo de la enfermedad causada por este oomycete (Kroumova y col., 2007).

Adicionalmente, se notificó la inducción de proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), como es el caso de la proteína PR-1a, que incrementa la resistencia de las plantas al patógeno (Alexander y col., 1993). Sin embargo, no se conoce con exactitud el mecanismo de acción de esta proteína, se supone que al igual que todas las PR-1, esta se unen a las proteínas canales de las membranas de las células e inhiben la liberación de calcio (Morrisette y col., 1995).

McIntyre y col. (1981), mostraron que en plantas de N. tabacum que contenían el gen N, al ser inoculadas en las hojas inferiores con el TMV se indujo la respuesta SAR, proporcionando protección contra la infección posterior con P. hyoscyami f sp. tabacina. Ensayos mediante el empleo del cultivar de tabaco KY14, que contiene el gen N, revelaron que la inoculación inicial con TMV o P. hyoscyami f sp. tabacina, incrementó la actividad de las ß-1-3- glucanasas (PR-2) (Ye y col., 1990). Además, se observó a través del uso de plantas transgénicas, que la expresión de las PR-2 tiene un papel importante en la protección de plantas contra este patógeno (Ryals y col., 1996; Lusso y Kuc 1996).

Hasta la fecha, no se conoce en que momento del proceso infeccioso es que actúan estas proteínas. No obstante, se demostró que hidrolizan a los ß-(1,3)-glucanos, presentes en la pared celular de hongos (Hernández y col., 2005). Con respecto a los esporangiósforos y las esporangiosporas, que emergen a través de los estomas, se determinó que son inhibidos por la acción del ß-ionone (Schiltz 1974; Salt y col,. 1986), el cual es un terpenoide volátil sintetizado por las plantas a partir de los carotenoides (Simkin y col., 2004).

Una característica importante, de varias especies silvestres de Nicotiana spp, es la resistencia hospedante. Tal es el caso de algunos genotipos de la especie desértica N. obtusifolia, los cuales responden a infecciones foliares con P. hyoscyami f sp. tabacina, mediante el desarrollo de lesiones necróticas a los cinco y seis días después de la inoculación, con reducción de la posterior esporulación del patógeno, en comparación con interacciones compatibles. Existen evidencias de que la resistencia en N. obtusifolia, resulta de la expresión de la HR y es producto de la acción de un gen simple de dominancia parcial, denominado Rpt1 (Heist y col., 2004).

Otra especie, Nicotiana langsdorffii, también manifiesta una resistencia determinada por el gen simple dominante NIRPT y presenta lesiones necróticas que son debidas a la HR (Zhang y Zaitlin 2008). Ambos genotipos de Nicotiana son fuentes naturales de resistencia a P. hyoscyami f sp. tabacina, que puede ser transferida al cultivo del tabaco (N. tabacum) mediante el cruzamiento genético tradicional (Heist y col., 2004; Zhang y Zaitlin 2008).

Técnicas empleadas para la construcción de librerías de ADNc

Entre las técnicas empleadas para la construcción de librerías de ADNc, representadas por fragmentos raros o poco comunes, la Hibridación Sustractiva por Supresión (SSH) es una de las más efectivas. La SSH se basa en la Reacción en Cadena de la Polimerasa y combina la normalización y la substracción en un procedimiento simple.

El paso de normalización iguala las cantidades de los fragmentos inducidos, con relación a la población de ADNc y la sustracción elimina las secuencias comunes entre las poblaciones de ADNc constitutivo e inducido. Esta metodología permite la identificación de genes expresados diferencialmente durante procesos infecciosos (Diatchenko y col., 1996; Mahalingam y col., 2003; Nobile y col., 2008).

Para caracterizar la función de un gen en plantas, una de las técnicas utilizadas es el silenciamiento de genes mediado por vectores virales (VIGS). Esta se basa en el silenciamiento postranscripcional del gen, mediante el clonaje de pequeñas secuencias del mismo dentro de un vector viral, que se utiliza para infectar plantas jóvenes (Ratcliff y col., 2001).

En pocas semanas, la planta a través de sus mecanismos defensivos, suprime la replicación directa del virus y degrada de forma específica el ARNm correspondiente al gen endógeno de la planta que se quiere silenciar. Esta técnica permite la caracterización de fenotipos y ofrece un potencial para el silenciamiento de miembros múltiples e individuales de la familia de un gen (Burch-Smith y col., 2004).

Ejemplos de ello se ponen de manifiesto en el empleo del Tobacco mosaic virus (TMV), Potato virus X (PVX), Barley stripe mosaic virus (BSMV) y Tobacco rattle virus como vectores de silenciamiento, para el estudio a gran escala de la función de genes en plantas de Nicotiana benthamiana (Fitzmaurice y col., 2002; Lacomme y col., 2003 Lu y col., 2003).

Véase también

• Plagas y enfermedades del cultivo del tabaco en Cuba

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